FlowJo 流式细胞分析软件 V10.9

FlowJo是一款流式细胞分析软件，用于分析和可视化流式细胞仪数据。它支持导入各种流式细胞仪产生的原始数据格式，提供广泛的工具和算法，可以对单个样本或多个样本进行分析和比较。FlowJo还可以用于多种应用，如细胞表型分析、细胞亚群分析、荧光染色分析、蛋白质结合分析等。它还提供了一些高级功能，例如自动补偿、事件子集、可视化统计和绘图等。FlowJo适用于生命科学研究和临床实验室中的科学家和研究人员。

FlowJo软件功能

A.阶梯式设门

FlowJo独特的阶梯式设门试一次革命性的创新。他一改传统复杂的逻辑门设置，将细胞群之间的逻辑关系用简单的递进阶梯式去呈现，并可以自定义细胞群名称、进而直观的现实细胞群统计值，让分析结果一目了然，简单清晰。

B.图像呈现法

B1.多维参数显示

FlowJo提供了灵活的数据呈现方式，全方位满足用户的数据分析需要。它可以呈现一维的直方图，传统的二维图形，及动态立体的三维图形，从多个角度和空间对数据进行360°的静态以及动态解析。

B2.多种图形类型

FlowJo除了提供传统的散点图，还提供多种图形类型（如密度图，等高图，伪色图，斑马图等），在满足不同分析需求的同时还保证了图像的美观和科学严谨需求。

C.多种设门工具

设门是流失数据分析中界定细胞目标群的必要手段，不管要检测的目标细胞群是规则分布还是不规则分布，小概率事件还是大概率事件，FlowJo提供了多种设门工具，从而让用户方便的界定各种细胞群。

D.强大的批量处理功能

用户可以做一个样品的门分析，然后将这个分析批处理应用到其他样品上；也可以做一个样品的图形分析，然后将这个分析批处理用到其他样品上。这样避免了对每一个样品进行重复性试验的分析，即保证了数据分析的一致性及灵活性，同时也极大地提高了分析的效率并且得到完美的分析结果。

D1.门的批处理

你可以将一个样品的门分析，批量应用到其他的样品上。整个过程只需要轻轻拖动鼠标就可完成，非常简单。

D2.图形分析的批处理

图像处理也可以用批量分析的方法，将一个样品的分析应用到其他样品上。

E.多种分析平台及工具

FlowJo自身包含了多个特殊的分析平台来满足细胞周期，细胞增殖，动力学（钙离子流量）等的分析。这些平台采用权威的已发表的模型算法原理设计，来精确模拟数据分布。FlowJo还包含了多种独特的分析工具，如数据联结、衍生参数轴、校准、Backgating、Show Ancestry、Sample Comparision等，让你对数据作进一步的深层分析及处理。

F.荧光补偿

荧光补偿是六十分析里面一个重要的概念也是一个复杂的过程，却是流式分析必不可缺的部分。软件补偿一改过去在机器上手动调节补偿的冗长复杂过程，大大简化了荧光补偿过程，将补偿数据的过程变成一个可理解，可见的简单过程，同时提供了在机器上手动补偿所没有的精确度和灵活性。

G.灵活方便的数据导出

数据的导出在FlowJo里面非常的轻松方便。不管是图形数据还是数据表格，都可以方便的导出成各种格式用来做数据的分享和发表。

FlowJo10使用教程

【处理流式数据】

1、打开FlowJo10，鼠标直接拖动数据所在文件夹到软件中导入数据

2、对数据进行处理:双击fcs格式数据出现流式散点图(建议首先对空白组细胞先处理)，圈门(根据实验目的选择合适的圈门工具)并点击ok确定

3、双击圈门部位，根据实验目的以及染料的荧光激发/发射波长，选择流式图合适的横坐标和纵坐标。完成后，关闭处理界面，回到软件主界面

4、对其他数据进行批处理，鼠标拖动已处理文件到All samples

5、点击布局管理器。并拖动已处理文件到布局管理器内

6、输出图片，可以点击保存按钮(命名时需要输入后缀.png)，或者在图片右击复制然后黏贴到PPT/Word中

【自定义参数轴窗口】

点击图形窗口界面的“T”按钮，选择“自定义参数轴”，打开自定义参数轴窗口

①更换坐标轴的类型：Linear，Logarithmic，Biex

②手动输入坐标轴的范围，包括最大值和最小值

③通过增加和减少按钮调整坐标轴的范围

④当使用Biex坐标轴时，调整Extra Neg. Decades值的大小，

⑤当使用Biex坐标轴时，调整Width Basis值的大小

【多色流式数据分析时调整某个荧光参数的坐标轴】

1、导入数据，设门分析后得到了CD4 vs. CD8的点图，如下图所示。对于补偿过的荧光参数，FlowJo 10会默认以Biex坐标轴来显示，而且软件自动对其Extra Neg. Decades与Width Basis值进行了调整

2、在下图中，我们能发现最右边的一群细胞有压轴的现象，而且软件也给出了提示：有一小部分细胞压在了X轴上，因此需要对Y轴坐标轴的范围进行调整

3、点击Y轴的T按钮，打开“自定义参数轴”窗口，将Extra Neg. Decades由默认的0调为1，再增加一段负的刻度段来将0以下的所有数据完全显示出来

4、点击“应用”按钮，得到结果如下图所示：原来压轴的数据完全显示出来了

FlowJo常见问题

1.散点图中怎样调整坐标轴的范围

(备注：只有FCS3.0格式的数据可以在散点图中调整坐标轴的范围。)

点击坐标轴旁边的“T”按钮，选择“Change displayed parameter range”，

在弹出的对话框中输入坐标轴范围的最小值和最大值。

2. 直方图中怎样调整Y轴的范围

在图形窗口中打开“option”选项，在“Y Axis”中选择“Auto”或者“Manual”，

Auto：自动，软件能自动调整Y轴的范围，将整个直方图显示出来

Manual：手动，需要在后面的“Max”选项中手动输入Y轴标度的最大值，然后按“回车键”确认。

比如，在此例中需要将“Max”值设为160。

3. 反向设门：怎样显示子细胞群在其祖先细胞群中的位置

在布局页中右键单击某个细胞群的图，在弹出的下拉菜单中选择“Show Backgating”

4. 输出图形时怎样自动对齐

在布局页中选中需要对齐的多个图形，到布局页的“排齐”菜单中选择对齐的类型，常用的有：顶端对齐(Tops)、底部对齐(Bottoms)、左对齐(Lefts)、右对齐(Rights)

5. 输出图片的格式有哪几种，哪种的分辨率最高

可输出的图形格式有6种：PNG, JPG, GIF, SVG, EMF, PDF。其中，SVG为可缩放矢量图形，EMF格式可以在microsoftoffice里面进行编辑。

在做图形输出的时候，如果是用作PPT的话，建议在FlowJo里面编辑完毕后再直接将完整的report输出到PPT，不建议在PPT里面做图形编辑。如果一定要在PPT做图形编辑的话，需将图片保存为EMF格式，这样可以在PPT2003版本里面做ungroup，进行单个编辑，不过图片插入PPT后，转变为PPT可识别的图，将会降低分辨率。

如果是用作发表文章的话，建议将图片保存为PDF格式，再在专业的图片编辑器如Photoshop或者Illustrator里面进行编辑，再输出为杂志要求的文件格式，一般为JPG,现在也有杂志倾向于接收PDF图片。

FlowJo默认的图形输出格式为PNG格式，如果需要更改，到“编辑”菜单栏里选择“偏好设置>文件格式”，在“布局编辑器”的输出格式类型中选择：

6. 是否可以调整伪色图中每个点所表示的细胞个数，即调整点的数目，使其分辨率更高

不可以调整。但是Dot Plot可以调整。(具体内容请参考博文：如何比较不同细胞数目的流式数据?)

7. 应用模板分析数据时，导入数据之后，布局编辑器里的图形批处理结果显示为“No Population”

在这个例子中，在布局页中选择“Exp1”，然后点击“Batch”按钮，重新批处理一次，便可得到结果。

8. Mean, Median, Mode, Geom.Mean的区别

Mean：平均荧光强度

Median：荧光强度的中位数

Mode：众数，是一组数据中出现次数最多的数值

Geometric mean：几何平均数，是指n个观察值连乘积的n次方根，计算公式为：

在标准的高斯分布情况下，Median=mean=mode. 通常在流式中因为总会有异常值(超高或者超低值)的存在，不是完美的高斯分布，建议使用Median，降低异常值对数据的影响。

9. 对于不同样本，目标细胞群所设的门的范围及位置不相同，是否影响可比性

不影响。同一组实验中的不同样本，目标细胞群的位置和分布范围可能会有变化，在设门的时候，需要将目标细胞群都划在门内;而在分析数据的时候，是以统计学方法分析整个细胞群的分布情况，得到百分比以及平均荧光强度等数据。因此不会影响可比性。